2016年12月1日，清華大學生命科學學院、結構生物學高精尖創新中心高寧課題組和合作者在《Nature》在線發表題為Mechanistic insights into the alternative translation termination by ArfA and RF2的研究論文。該論文報道了大腸桿菌中non-stop mRNA在核糖體上的翻譯終止狀態復合物的高分辨冷凍電鏡結構，并揭示了ArfA在non-stop mRNA翻譯終止過程中的作用機制。
核糖體上的蛋白翻譯是一個非常復雜的過程，包括翻譯起始、延伸和終止等多步嚴密調控的步驟。在細菌中，當蛋白翻譯進行到mRNA上的終止密碼子時，翻譯終止因子RF1或RF2可以直接識別終止密碼子，結合到核糖體上的活性中心，催化釋放共價偶聯在肽酰tRNA 3’末端上的新生肽鏈，這個過程受RF1/RF2上保守的催化活性基序Gly-Gly-Gln（GGQ）序列的調控。在細胞中，由于轉錄提前終止、mRNA錯誤加工、藥物或者物理損傷等會導致細胞中產生缺少終止密碼子的mRNA，這類mRNA被稱為non-stop mRNA。當核糖體移動到non-stop mRNA的3’末端時，由于缺少終止密碼子對RF1/RF2的激活作用，核糖體會停滯在mRNA的3’末端并且不能夠進行正常的翻譯終止。細胞中積累過多停滯的核糖體會產生毒性，真核生物和原核生物都進化出了相應的質量控制體系來回收這些核糖體。在細菌中，一類針對non-stop mRNA的挽救系統依賴于一種小蛋白ArfA（alternative ribosome rescue factor A）。現有的少量遺傳和生化數據表明，當核糖體停滯在non-stop mRNA的3’末端時，ArfA結合到核糖體上的解碼活性中心，招募并激活RF2的肽酰水解活性，從而釋放新生肽鏈。然而，眾多機制相關的問題尚不清楚，例如ArfA是如何激活RF2的水解功能？ArfA如何區分不同長度mRNA結合的核糖體？
高寧課題組在體外組裝了ArfA/RF2、non-stop mRNA、tRNA與70S核糖體的復合物，并獲得了該復合物的高分辨冷凍電鏡結構（3埃分辨率，核心區域接近2.6埃）。結構表明ArfA C端的loop結合于核糖體30S小亞基上的mRNA進入通道，并部分地占據了終止密碼子的結合位點，而N端則直接與30S解碼中心及RF2相互作用。進一步的分析表明ArfA扮演了兩個重要的角色：其N端作為mRNA長度的感受器（Sensor），如果核糖體尚未行進到mRNA的3’末端，mRNA進入通道內的核苷酸會阻礙ArfA的結合；其C端則通過和RF2直接結合，從功能上補償了終止密碼子對RF2的激活效應。
這項研究展示了自然界的一種奇妙的功能模擬機制：具有極大結構柔性的小蛋白可以通過結構模擬來取代mRNA上的三堿基終止密碼子的功能。值得一提的是，在這項工作發表的同一天，Nature和Science同時在線發表了來自德國（慕尼黑大學Wilson實驗室）和英國（MRC Ramakrishnan實驗室，2009 Nobel化學獎）科學家的相似的工作。
圖：ArfA在核糖體上的結合位點
高寧研究組的博士生馬成英和日本弘前大學（Hirosaki University）的Daisuke Kurita博士為該論文的共同第一作者。高寧和Hyouta Himeno教授為共同通訊作者。高寧研究組成員李寧寧和陳燕也參與了本課題的研究。冷凍電鏡數據采集得到了國家蛋白質科學設施（北京）的清華大學冷凍電鏡平臺支持，數據處理得到國家蛋白質科學設施（北京）清華大學高性能計算平臺的支持。部分計算處理也得到了了北京大學生命聯合中心高性能計算平臺的支持。本工作獲得清華大學結構生物學高精尖創新中心、教育部蛋白質科學重點實驗室、科技部重大科學研究計劃專項、國家自然科學基金委等的經費支持。
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